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怎么又没连上啊😭😭😭
很多刚进实验室的研究生，最开始接触的分子生物学可能就是载体构建了。但是，多数新手在载体构建初期会发现，老师让我构建三个载体，一个月过去了，一个都没构建成功。师兄说：“这个载体交给我，一周我就给你搞好了 😂”。于是，新手陷入深深的自我怀疑，‘我明明是按照protocol做的，为什么板子老是空空如也，长出来的单克隆也不对呢’。其实，往往新手会陷入无限重复的误区。搞懂一下几点，应该会提高你的成功率。
👉 几个概念
- gDNA. 全称为genomic DNA，即基因组DNA，是生物体全部都遗传信息。通常，师兄让你提DNA就是提取的基因组DNA。gDNA在每个体细胞的组成是一致的。
- Transcript.即转录本，是gDNA转录后的mRNA。DNA在转录过程中，会切除内含子，保留外显子，将外显子拼接好即形成转录本。有时候，同一个DNA可能会产生不同类型的转录本，发挥不同功能。
- UTR.全称为Untranslated Region，即5’和3’非翻译区，该区域可以被转录，但是不编码蛋白质，即不翻译成为蛋白质。注意，并不是每个基因都具5’和3’UTR，有的基因可能只有这两个区域的其中一个。
promoter.启动子，通常位于某个基因上游发挥作用，通常转录因子可以结合启动子来调控基因表达。注意：启动子是gDNA序列。
当我需要扩增启动子时，应该以DNA作为模版。 当我需要扩增基因时，应以cDNA为模版。
👉PCR注意问题
新手扩增PCR时经常出现扩增不出来条带或者这样那样的问题，这是正常现象。但是，我们如果注意几个问题，往往会少走很多弯路。
- 分析序列。首先分析扩增目标片段GC含量是否异常，尽量避免在GC含量高的地方设计引物。
- 设计巢式PCR引物往往会提高扩增成功率。
- 同一个基因可能会构建到不同目标载体，成功构建一个后，以该质粒为模版扩增其他载体目标片段。不要再傻傻用cDNA作为模版了。
👉连接注意问题
连接是载体构建的重要环节，很多新手因为这一步不注意导致失败。应注意一下几个问题。
- 空载体正确酶切。新手往往是从师兄，师姐那里拿取质粒进行酶切，或者是其他人切好的线性化载体。如果为别人切好的，应认真核实是否为你所需要酶切位点。如果为完整质粒，应根据浓度设计酶切实验。（很多新手不管浓度直接按照体系酶切，造成酶切不完全）
- 连接体系优化。连接时，需根据载体与目标片段大小及浓度合理优化连接体系，并非生搬硬套别人体系，往往会导致连接失败。
- 仔细阅读说明书。现在实验室基本都采用试剂盒进行连接转化，因此，应认真阅读说明书，根据说明书优化体系。
👉转化注意问题
转化时，可选择空载体作为阳性对照，酶切载体作为阴性对照。
👉阳性克隆检测
转化后长出单克隆，心里美滋滋。鉴定阳性克隆是非常重要的。通常，可以做菌落PCR或者菌液PCR，如有目标条带，大概率没问题。可以进行质粒提取、酶切鉴定、测序验证。
🚨提醒
- 新手做实验应做好阳性及阴性对照，不然，很难找到问题所在。例如，做PCR时应该以H2O为模版作为阴性对照。转化时应该以质粒为模版作为阳性对照。
- 遇到问题，问对人。当遇到问题时，建议询问实验室高年级有经验的人或者直接咨询老师，尽量避免同年级人互相请教，往往可能错上加错 😂
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- 作者:mtnf
- 链接:https://mtnf100.top/article/d7b8d6ff-75e6-4806-8dde-bda766fc6daf
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