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原生质体提取是植物分子生物学常用技术，在蛋白亚细胞定位，蛋白间相互作用，蛋白和DNA互作等方面均发挥重要作用。水稻和拟南芥分别作为禾本科作物和双子叶模式植物，二者的原生质体分离和瞬时转化技术已较为成熟。根据自身研究经验，分享水稻原生质体分离和瞬时转化中的问题和技巧，以及浅谈与拟南芥原生质体分离的不同。
📝 主旨内容
材料选择：
- 水稻茎、叶鞘、根以及愈伤组织均可用于原生质体分离。如果没有组织特异性要求，一般选择在MS培养基生长10-14天幼苗作为提取原生质体材料（需去处根部及叶片）。
- 与水稻不同，拟南芥原生质体提取一般选择未抽薹拟南芥叶片为材料，一般要生长3-4周。这点来看，水稻生长周期更短，操作更加容易。
试剂准备
- 原生质体获取前期主要是消化细胞壁，用到的是纤维素酶（Cellulase RS或者Cellulase R-10）、离析酶（Macerozyme R-10）。根据经验，日本Yakult公司的两个酶是效果最佳的。
- 其他试剂如KCI, CaCI, MES，BSA，甘露醇，最好现用现配，有条件的最好用SIGMA公司产品。根据经验，国药产品也不差。
原生质体提取
- 水稻原生质体提取需将幼苗茎部用锋利刀片切成1-2mm段，并迅速转移至酶解液（避光），抽真空5-10分钟后于室温孵育4-5小时。
- 拟南芥则是将叶片用刀片切成1-2mm细条状，转入酶解液后80 rpm室温孵育3小时。
关键步骤：
- 对于水稻而言，原生质体释放在于加入W5洗。酶解结束后，可将酶解液过滤除去，加入新鲜配置的W5,室温继续孵育释放原生质体，或者加入W5用力摇晃释放W5。多次重复上次步骤，即可获得全部原生质体。
- 拟南芥原生质体在酶解液中已几乎全部释放，只需用W5洗去残留酶解液即可。
- 离心时最好用水平转子并选用圆底管，升降速调为1。
质粒转化
- MMG重悬原生质体时，需根据原生质体数量确定MMG体积，一般每个转化需达到2x10个原生质体。
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- 质粒要求浓度达到1ug/ul，而且要去除内毒素，一般用试剂盒提取即可。
- 质粒，MMG，PEG需轻柔充分混合才可达到最佳转化效率
下游实验
下游实验如蛋白表达，Co-IP，BiFC，DLR，qRT-PCR，ChIP等，一般黑暗培养的原生质体离心后去除上清即可液氮速冻，然后-80度超低温冰箱保存用于下游实验。DLR需立即用裂解液裂解原生质体。BiFC需用激光共聚焦显微镜立即观察。ChIP一般需交联后冻存。
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- 作者:mtnf
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